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产品描述

高产量T7 Fluorescein RNA转录试剂盒是专门用于体外转录中产生随机Fluorescein修饰RNA的试剂盒，本试剂盒通过优化的反应缓冲液和T7 RNA聚合酶可将Fluorescein-12-UTP有效地结合到RNA中，代替其天然对应物UTP，所得到的Fluorescein修饰的RNA可通过荧光光谱法检测。每个标准反应以1 μg对照模板可产生60 ~120 μg Fluorescein修饰的RNA，每个试剂盒可产生高达2.4 mg Fluorescein修饰的RNA。

储存条件

-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。

注意事项

1. 实验时请佩戴一次性手套及口罩，规范操作。

2. 使用RNase-free的实验耗材，防止产物被RNase降解。

3. 转录模板需要纯化，并确保条带单一。

反应体系

1. 制备以下反应混合物：

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2. 将反应溶液轻轻混合均匀，并于避光条件下37°C反应2 ~ 8小时。

注意：若合成的是dsRNA，37°C反应结束后，请于避光条件下72 °C孵育10 min，再于室温条件下放置20 min，以退火形成Fluorescein修饰的dsRNA。

3. 在反应体系中加入1 μL的DNase I（2 U/μL），37℃孵育15 min，去除DNA模板。（可选）

注意：相对于产物RNA，模板DNA的含量非常低，一般不用去除，也可以用DNase I消化。

4. 合成的Fluorescein修饰的RNA经电泳分析、纯化后，可用于下游实验。

产物纯化

1. 磁珠纯化：植生优谷RNA纯化试剂盒（磁珠法）（PU002），能够在30分钟内获得高纯度RNA。在有效去除游离核苷酸、蛋白质等杂质的同时，能减少实验过程中有机试剂的使用。

2. 苯酚/氯仿抽提及乙醇沉淀：加入等体积苯酚/氯仿混合物抽提；再用氯仿抽提两次；用两倍体积的无水乙醇沉淀RNA；用70%乙醇洗涤RNA沉淀两次；用Nuclease-free Water重悬沉淀、溶解RNA。

3. 色谱柱法：色谱柱可以去除非结合核苷酸、蛋白及盐分。如果产物超过柱子结合能力，则需要额外色谱柱。

dsRNA定量

紫外吸收法：Fluorescein修饰的RNA浓度可以通过260 nm处吸光度值进行测量。游离核苷酸会影响定量的准确性，采用此方法前请先进行RNA纯化。