每日科研进展 l 2022.05.07 l RNAi在害虫防控应用中实验参数的设计与指导

RNAi在害虫防控应用中实验参数的设计与指导

RNAi技术通过抑制靶标物种特定的基因，导致发育缺陷、死亡和行为改变，进而达到害虫防控的目的。但是目前对于RNAi技术在害虫防治中的研究不太规范。该论文对于已经发表过的实验数据，通过机器学习算法分析，预测与RNAi试验有效性相关的因素。结果表明，针对于RNAi实验，响应时间和目标基因是最重要的变量，其次是dsRNA使用剂量、dsRNA长度以及所选择的目标物种（图 1）。该篇论文对标准化RNAi实验开展提供一定的指导，以加速RNAi作为防治害虫的有效工具的开发。

图 1. 影响RNAi效果的实验因素变量分析

该研究共调查了350篇论文，经过筛选，82篇研究RNAi害虫防治的文章被用来进一步分析。结果共包含979个数据点，来源于8个目的54种昆虫。

靶标基因

靶标基因是影响RNAi效率的重要因素。首先将不同昆虫的靶标基因进行分析，使用果蝇的同源基因进行命名后，归一处理后靶标基因数目为192个，其中Vha及其subunits在数据集中数量最高（n = 51），占所有使用的目标基因的7.4%。统计分析后，Vha、Ace、chitinase、COPI coatomer和cellulase是研究最多的五类靶标基因，占基因总数的24.5%（图 2）。

图 2. RNAi实验常用靶标基因统计与分布

 使用较低剂量（0.027~24 μg）的dsRNA，抑制Vha基因，对双翅目、鞘翅目、半翅目、和鳞翅目昆虫的平均致死率为70%±26.7%。

响应时间

不同研究报告显示RNAi实验产生最大死亡率的时间不同。例如，在烟粉虱中，抑制Vha基因的表达，48h死亡率能够达到70%。但是，在温带臭虫中，使用0.5~0.05μg的dsVha注射处理，28天后死亡率达到80~85%。在德国小蠊中，通过饲喂的方法，抑制tub基因的表达，16天后，死亡率大于60%。饲喂鳞翅目昆虫美洲棉铃虫针对PBAN基因的dsRNA，20天后，死亡率达到70%以上。这些结果表明，实验的持续时间对死亡率似乎有明显的影响。

dsRNA长度

在RNAi实验中，用到的dsRNA长度各异，多数是100bp到800bp之间，甚至包含1872bp的全长CDS全长序列。对dsRNA长度分析统计显示，125bp~628bp之间的序列，能够引起有效的RNAi效应。

此外，在果蝇细胞系中，针对于Sid1基因的研究表明，使用100bp的dsRNA，相比与500bp的dsRNA，需要100到1000倍的剂量才能达到相同的沉默效果。

对秀丽隐杆线虫、双斑点线虫、叶螨、赤拟谷盗等进行试验分析发现，目前对无脊椎动物的研究结果表明，最佳的dsRNA长度可能在100~ 600 bp之间。

昆虫类型

具有较高RNAi效率的昆虫，研究的也就更多。目前文献中，对于鞘翅目，其次是鳞翅目和半翅目昆虫研究的最多，这三类昆虫中，不管是通过注射还是饲喂dsRNA，均能够引起较强烈的RNAi效应。其它目的昆虫研究的相对较少。直翅目、缨翅目、双翅目和膜翅目的代表性较低。在所有被调查的目的昆虫中，RNAi引起的昆虫死亡率各不相同。同时，很多目的昆虫的RNAi通路核心基因已经被证实，但是在直翅目和双翅目中，对于其核心机制以及系统性了解的缺乏，可能限制了RNAi效应。

使用剂量

应用于昆虫的dsRNA剂量在数据集中范围很广，统计结果表明没有发现剂量效应对死亡率的明显证据。然而，也有个别报告显示剂量与死亡率之间存在正线性关系。报道的最低使用剂量是将cactus基因的dsRNA注射进赤拟谷盗中，使用的dsRNA长度为485bp，剂量为1.5E-08μg。该剂量在16天内导致目标昆虫75%的死亡率，剂量提高100倍后，能够使得死亡率增加到90%。此外，针对于4龄东亚飞蝗，注射20μg针对于Dicer基因的dsRNA，引起的死亡率达到64%，这个剂量与已经报道的最少使用剂量相差13亿倍。而在斜纹夜蛾成虫中，针对于PBAN基因注射高剂量的dsRNA，引起的致死率为0%。

饲喂剂量不能像注射一样量化，因为不确定有多少可用的dsRNA被昆虫摄取。但是可诱导死亡的dsRNA剂量的变化比注射试验窄，最大和最小剂量之间的变化范围为800倍（最小= 0.5μg，最大= 400μg）。在玉米根虫成虫中，在饲料中使用0.5μg针对于Laccase2和Vha的dsRNA，能够引起目标昆虫高达60%的死亡率。在饲喂实验中，用到的最高剂量是针对于东方果蝇核糖体蛋白RpL基因的dsRNA，使用剂量达到400 μg，然而并没有产生明显的致死效应。

使用方法

针对于调查数据来看，饲喂dsRNA是最常见的方法（n = 441），其次是注射dsRNA（n = 431）。统计分析结果显示，饲喂似乎显示了与注射相似的死亡率。饲喂方法包括人工饲料、转基因植物、浸渍叶片、转基因细菌、简单dsRNA溶液，均能引起显著的死亡率（高达100%）。

该研究论文通过对相关研究结果的统计分析与总结，确定了能够影响昆虫RNAi效率的因素，为RNAi技术在害虫防治中的应用提供一定的帮助。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/ps.6884