产品组分

产品描述

T7 RNA Transcription Kit V3是T7 RNA Polymerase以带有T7启动子的DNA为模板，四种NTP为底物，在较短的时间体外转录合成RNA。本升级版试剂盒优化了转录体系，2×R Buffer已预混了NTPs，比于一般试剂盒，简化了加样步骤，操作更加简便省时。每个标准反应投入1 μg DNA模板可产生100 ~ 200 μg的RNA。转录合成的RNA可用于诸如体外翻译、 反义RNA和RNAi实验、RNA结构与功能研究、RNase保护及显微注射及等多方面的下游应用。

 

储存条件

-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。

 

 

产品优势

1. 本产品中的底物与酶均以预混液形式呈现，减少了实验步骤，简单方便。

2. 本产品转录的RNA产量较高，每个反应体系可获得100 ~ 200 μg的高质量RNA。

 

自备材料

1. 合成模板：带T7启动子序列的线性化质粒、PCR产物或合成的DNA片段。

2. 纯化试剂：苯酚、氯仿、醋酸钠、乙醇；或RNA磁珠反应液；或RNA纯化柱；或氯化锂、RNase-free Water。

3. 其他器材：RNase-free的EP管及移液器吸头；磁力架或离心机；PCR仪或培养箱。

 

注意事项

1. 实验时请佩戴一次性手套及口罩，规范操作。

2. 使用RNase-free的实验耗材，防止产物被RNase降解。

3. 使用前各组分请瞬时离心再开盖，以免试剂损失或污染。

 

模板制备

1. 质粒模板：带T7启动子的质粒可以作为转录模板，质粒的线性化和纯度会影响转录的产量及RNA的完整性。环状质粒由于没有有效的终止，会转录出不同长度的RNA产物，为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化，线性化的质粒请确保双链为平末端或5’端为突出结构。质粒线性化后，需要纯化后再作为体外转录的模板。

2. PCR产物模板：带T7启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。可使用带T7启动子（TAATACGACTCACTATAGGG）的引物进行PCR扩增，电泳确认产物的单一性，PCR产物经纯化后作为转录模板。

3. 合成的DNA模板：化学合成的带有T7启动子的DNA片段也可以作为体外转录的模板。

 

转录反应

1. 取出试剂盒各组分，T7 RNA Polymerase Mix需放在冰上解冻，其余组分可置于室温解冻，使用前请瞬时离心。

2. 在室温条件下，按下表配制反应体系：

 

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3. 计算好体系，严格按照以下顺序加入各组分：水→Buffer→模板→酶，用移液枪轻轻混匀各组分，并短暂离心收集于管底， 将配好的反应体系于37°C反应2 ~ 4小时。

注意：若合成的是dsRNA，37°C反应结束后，请于72°C条件下孵育10 min，再于室温条件下放置20 min，以退火形成dsRNA。

4. 反应结束后，可能会出现白色的沉淀物，这是游离焦磷酸盐和镁离子在反应中产生的焦磷酸镁，不会影响后续实验，可以选择添加一些EDTA清除或者通过离心回收上清液。 5. 在反应体系中加入1 μL的DNase I（2 U/μL），37℃孵育15 min，去除DNA模板。（可选）

注意：相对于产物RNA，模板DNA的含量非常低，一般不用去除，也可以用DNase I消化。

6. 合成的RNA经电泳分析、纯化后，可用于下游实验。

注意：转录产物浓度可能会很高，需要使用Nuclease-free Water稀释后再进行检测。

 

产物纯化

1. 磁珠纯化：植生优谷RNA纯化试剂盒（磁珠法）（PU002），能够在30分钟内获得高纯度RNA。在有效去除游离核苷酸、蛋白质等杂质的同时，减少实验过程中有机试剂的使用。

2. 色谱柱法：色谱柱可以去除非结合核苷酸、蛋白及盐分。纯化时加入Nuclease-free Water将产物稀释至100 μL，再按照说明书进行纯化。如果产物超过柱子结合能力，则需要额外色谱柱。

3. 凝胶纯化：当需要高纯度和特定长度的RNA转录产物时，建议凝胶电泳后切胶回收纯化。凝胶电泳可以根据转录产物的长度选择琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。

4. 酚/氯仿纯化法：酚/氯仿抽提可去除蛋白和大部分游离核苷酸，可按照以下步骤进行实验:

（1） 加入160 μL RNase-free Water将产物稀释至180 μL；

（2）加入20 μL 3M的醋酸钠（pH 5.2）到稀释后的产物中，用移液器充分混匀；

（3）加入200 μL的酚/氯仿混合液（1：1）进行抽提，4℃ 12,000 rpm离心5 min，将上层溶液（水相）转移至新的RNase- free EP管中；

（4）加入与水相等体积的氯仿抽提2次，收集上层水相；

（5）加入2倍体积的无水乙醇并混匀，-20℃孵育至少30 min，4℃ 12,000 rpm离心15 min；

（6）弃上清并加入500 μL预冷的70 %乙醇洗涤RNA沉淀，4℃ 12,000 rpm离心5 min，弃上清；

（7）开盖干燥2 min，加入20 ~ 50 μL RNase-free Water或其他缓冲液溶解RNA沉淀，-80℃保存。

5. 氯化锂纯化：氯化锂纯化可去除游离核苷酸，可按照以下步骤进行实验:

（1） 加入30 μL的Lithium Precipitation Solution和30 μL的RNase-free Water，混匀后-20℃放置至少30 min；

注意：RNA小于300 nt或浓度小于0.1 μg/μL时，不能通过此方法等到有效沉淀。

（2）4℃ 12,000 rpm离心15 min，弃上清，收集沉淀；

（3）加入500 μL预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃ 12,000 rpm离心5 min，弃上清；

（4）重复上述步骤2次；

（5）开盖干燥2 min，加入20 ~ 50 μL RNase-free Water或其他缓冲液溶解RNA沉淀，-80℃保存。

 

产物检测

1. 电泳检测：可使用琼脂糖凝胶电泳、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳等方法，检测确认RNA产物的片段大小、完整性和质量。大于200 nt的转录产物可使用琼脂糖凝胶进行电泳分析，小于200 nt的转录产物可使用变性聚丙烯酰胺凝胶（5 ~ 15%）进行电泳分析。毛细管电泳检测只需要少量的RNA，高质量的RNA通过毛细管电泳检测后应显示出明显而尖锐的峰。

2. 浓度测定：RNA产物纯化后，可使用紫外分光光度计检测或RNA荧光定量检测RNA产物的浓度。建议将RNA产物稀释后再用紫外分光光度计测定260 nm处吸光度值来计算浓度，通过A260/280和A260/A230来判断获得的RNA产物的纯度。对于单链RNA，RNA浓度可按照以下公式计算：A260×稀释倍数×40= μg/mL RNA。

 

常见问题

1. 转录产物产量低

1）可能原因：

（1）DNA模板中存在抑制反应的成分。

（2）DNA模板本身质量不佳。

2）解决方案：用试剂盒中Control Template做一个对照反应，对照组产量正常， 但实验组产量低，说明模板本身存在问题，请尝试以下解决方案：

（1）重新纯化模板，避免RNase污染。

（2）进行模板定量并确认其完整性。

（3）可适当延长37℃反应时间，如过夜反应（16 h）。

（4）可加大模板投入量，如使用2 ug模板。

（5）模板的GC含量比较高，37℃条件下产量不高，可换成42℃。

（6）尝试其他的启动子或RNA聚合酶。

2. 转录产物电泳出现拖尾现象

1）可能原因：

（1）实验过程中存在RNase污染。

（2）DNA模板被RNase污染。

2）解决方案：

（1）建议重新纯化模板DNA，实验中所用试剂均用Nuclease-free Water来配制，使用RNase-free的枪头和EP管。

（2）在实验过程中规范操作，佩戴一次性手套和口罩。

3. 出现比预期更长的RNA转录产物

1）可能原因：

（1）质粒模板可能没有完全线性化。

（2）有义链 3’端为突出结构。

（3）RNA存在未完全变性的二级结构。

2）解决方案：

（1）检查质粒模板是否完全线性化，如有必要，重新进行线性化。

（2）选择合适的限制性酶，确保双链为平末端或5’端为突出结构。

（3）使用变性胶检测RNA产物。

4. 出现比预期更短的RNA转录产物

1）可能原因：

（1）模板序列中包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列。

（2）模板中GC含量高形成了类似茎环的终止结构。

（3）RNase污染。

2）解决方案：

（1）若模板中含终止结构，可尝试降低转录温度（如30℃）以增加长转录产物的比例，但总产量会降低。或尝试使用其他的RNA聚合酶进行转录。

（2）若模板GC含量高，改变温度至42℃进行孵育会增加长转录产物的产量。或尝试加入SSB蛋白以提高产量和转录产物长度。

（3）请注意操作规范，减少实验过程中的RNase污染。